В курсе химии средней школы на экологические вопросы обращается особое внимание. В решении экологических задач наиболее эффективным остается химический эксперимент, и не только эвристический, при котором учащиеся работают по четким инструкциям учителя и под его наблюдением, но и исследовательский. При таком эксперименте возможна различная степень самостоятельности учащихся. Ученическое исследование сочетает в себе использование теоретических знаний и эксперимента, требует умения прогнозировать , строить план исследования, а в некоторых случаях учащийся сам формулирует проблему , выдвигает гипотезу и разрабатывает эксперимент для ее проверки. Таким образом, при данной форме эксперимента от учащихся требуется максимальная самостоятельность. В настоящее время учителя используют много опытов с экологическим содержанием, часть которых посвящена изучению влияния различных антропогенных факторов на живой организм, в частности на белки, в том числе и на ферменты. Предлагаем опыты по исследованию влияния токсикантов на уреазу. Немаловажный фактор при разработке школьного химического эксперимента - доступность материалов и реактивов. Рассматриваемый фермент широко распространен в растительном мире, особенно высока активность уреазы в семенах некоторых бобовых. Для проведения эксперимента рекомендуем использовать уреазу арбузных семечек. В них активность этого фермента сохраняется в течение трех лет. Можно взять семечки кабачка, в них активность уреазы сохраняется в течение одного года. Лучше же брать семечки из свежих плодов. Уреаза катализирует гидролиз мочевины с образованием оксида углерода(IV) и аммиака:

Метод определения активности уреазы основан на тестировании выделяющегося аммиака фенолфталеином. Наглядность данного опыта обеспечивается быстрым появлением интенсивной розовой окраски индикатора.
Реактивы и оборудование: ступка с пестиком, пробирки, пипетки, 1 % раствор мочевины, 0,02 % спиртовой раствор фенолфталеина, дистиллированная вода, экстракт фермента, рабочие растворы токсикантов.

Определение активности уреазы

Приготовление экстракта уреазы

Очистить 3-4 арбузных семечка от кожуры и растереть ядра в ступке с 10 мл воды. Данный экстракт слить в пробирку и использовать для проведения опытов.

Ход опыта

Для опытов взять 2 мл суспензии ферментативного препарата. В пробирку добавить 1 мл воды или токсиканта (солей тяжелых металлов или фенола), встряхнуть и добавить 2 мл раствора мочевины. Следует подчеркнуть, что необходимо добавлять реагенты в той последовательности, о которой сказано выше. Затем в пробирку добавить 2-3 капли спиртового раствора фенолфталеина, оставить при комнатной температуре на 3-5 мин. По интенсивности появляющейся окраски фенолфталеина судят об ингибировании фермента. Если окраска появляется, значит, уреаза сохраняет свою активность, так как выделяется аммиак, а если окраска индикатора не появляется, значит, реагент ингибирует фермент. В опытах используются различные концентрации токсикантов. Готовить растворы солей и фенола необходимо с учетом разбавления при проведении опыта. Токсиканты в одних концентрациях ингибируют фермент, в других нет. Исследовательский компонент эксперимента состоит в нахождении такой концентрации фактора, прии которой начинается ингибирование уреазы.

Влияние катионов тяжелых металлов на активность фермента

Поступая в биосферу, тяжелые металлы активно включаются в различные миграционные циклы эко- и геосистем и представляют потенциальную опасность для всего живого. Соединения тяжелых металлов способны сохранять токсичность практически бесконечно, так как при их превращении металл остается без изменений. Катионы металлов, поступающие в организм человека или животного из окружающей среды, образуют прочные связи с карбоксил-анионами и часто вызывают разрывы ионных взаимодействий между ионизированными боковыми радикалами аминокислотных остатков в глобуле, что приводит к потере активной структуры белка. Они снимают электрическую поляризацию белка, уменьшая его растворимость. Вследствие этого находящийся в растворе белок выпадает в осадок. Такие токсичные элементы, как Be, Cd, Sr, Cs, легко могут атаковать белки-ферменты, конкурируя с биогенными элементами и вытесняя их. Например, очень токсичный ион Cd²⁺ конкурирует с ионом Zn²⁺, выполняющим в металлсодержащих ферментах роль кислоты Льюиса и создающим локальный положительный заряд около активного центра фермента. Замещение Zn²⁺ на Cd²⁺ приводит к дезактивации ферментов. Свинец и все его соединения ядовиты. Попадая в клетки, свинец, как и многие другие тяжелые металлы, дезактивирует ферменты, взаимодействуя с SH - группами белков - составляющих ферментов. Кадмий считается токсичнее свинца и отнесен Всемирной организацией здравоохранения к числу наиболее опасных для человека веществ. Не менее опасны эти металлы и для растений.

О п ы т 1. Изучение влияния солей тяжелых металлов на активность уреазы. В качестве токсиканта надо использовать растворы ацетатa свинца Pb(CH₃COO)₂ и нитрата кадмия Cd(NO₃)₂ в различных концентрациях (10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9 моль/л). Эксперимент следует проводить по вышеприведенной методике.
Результаты опыта занести в таблицу.

Концентрация, моль/л	Cd(NO3)2	Pb(CH3COO)2	Контроль
10-6 10-7 10-8 10-9

В таблице ставят знаки:
"+" - реагент ингибирует фермент;
"-" - реагент не ингибирует фермент.

Влияние фенола на активность уреазы

Фенольные соединения представляют особую опасность для окружающей среды из-за широкой распространенности, высокой концентрации и токсичности.
Действие фенола зависит от его концентрации, физико-химических характеристик среды, физиологического состояния растения, его видовой чувствительности. В отличие от тяжелых металлов фенольные соединения реагируют с растениями быстро, однако они неустойчивы. Промежуточные продукты окисления фенолов - хиноны - имеют высокую реакционную способность и могут рассматриваться как вторичные токсины. Окисление идет по схеме:


Многообразие структур молекул фенольных соединений позволяет предположить, что хиноидный путь - лишь один из возможных путей проявления их токсичности. Так, некоторые фенольные соединения токсичны для растений за счет повышенных электроноакцепторных свойств, из-за способности образовывать хелатные комплексы и выступать в роли денатурирующих агентов, поверхностно-активных веществ, протонофоров, биологических депрессантов. По-видимому, в некоторых, если не в большинстве, случаях фитотоксичность фенольных соединений отражает суммарный эффект, определяемый одновременно различными свойствами молекулы.

О п ы т 2. Изучение влияния фенола на активность уреазы.
Для проведения опыта необходимо приготовить 0,5 М раствор фенола (с учетом разбавления в процессе эксперимента). Для этого 4,7 г фенола разбавить 10 мл воды. Исследование влияния фенола различных концентраций (1, 10^-1, 10^-2, 10^-3 моль/л) проводится с добавлением разных объемов исходного раствора фенола (0,5 моль/л) в опытные пробирки. До необходимого объема токсиканта (1 мл) добавить воду. В контрольную пробирку - 1 мл воды.
Опыт выполнять по вышеприведенной методике.
Результаты занести в таблицу.

Концентрация, моль/л	Фенол	Контроль
1 10-1 10-2 10-3